PCR基因扩增仪的工作原理,PCR技术基本原理

by admin on 2019年12月20日

导读:北京莱普特PCR扩增仪被广泛地运用在医学和生物学的实验室,例如用于判断检体中是否会表现某遗传疾病的图谱、传染病的诊断、基因复制,以及亲子鉴定。知晓北京莱普特PCR扩增仪的使用原理才能更好的操作它。

什么是PCR技术?PCR(PolymeraseChainReaction)技术,中文译为聚合酶链式反应,是一种在体外(试管、切片)扩增核酸的技术。

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北京莱普特PCR扩增仪的工作原理

什么是PCR技术?PCR(PolymeraseChainReaction)技术,中文译为聚合酶链式反应,是一种在体外(试管、切片…)扩增核酸的技术。PCR的基本反应包括以DNA为模板的反应和以mRNA为模板的反应。PCR技术是模拟体内天然DNA(脱氧核糖核酸)的复制过程。以扩增DNA为例,其基本原理是在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下,特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。

PCR,聚合酶链式反应(Polymerase Chain
Reactionm),是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术,它可看作是生物体外的特殊DNA复制,PCR的最大特点,是能将微量的DNA大幅增加。1985年美国PE公司人类遗传研究室发明了PCR技术,Saiki等首先应用于镰状红细胞贫血的产前诊断,但由于操作方法繁琐未能全面推广应用。直到1988年耐热DNA聚合酶(Taq酶)的发现和应用,使PCR技术变得极为简单,才被迅速应用于分子生物学、生物工程、医学、法医学和农学等领域。

类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR基因扩增仪的工作原理是怎样的?PCR反应一般设置20~40次循环,每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。每一循环的产物作为下一个循环的模板。PCR的扩增效率很高,如果循环次数是30次,那么新生DNA片段理论上达到230拷贝(约为109个分子)。

1、PCR基本要素

PCR由变性–退火–延伸三个基本反应步骤构成:

PCR反应每个循环的三个基本反应步骤如下:

PCR基本要素与DNA复制的基本要素是一致的。

①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;

①模板DNA的变性:模板DNA经加热至94℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA产物解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;

①DNA模板:待拷贝的 DNA 称为模板,它可以是双链 DNA
也可是单链DNA,最后扩增得到的产物是双链状态的。

②模板DNA与引物的退火:模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;

②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;

②引物:是 DNA 复制的先锋,就象结晶过程中的晶核,引导 DNA 的合成。在 PCR
扩增中一般使用合成的寡核苷酸作引物。

③引物的延伸:DNA模板–引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA
链互补的半保留复制链重复循环变性–退火–延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2——4分钟,2——3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

③引物的延伸:温度升到72℃左右,DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性–退火–延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。PCR技术的特异性取决于引物与模板结合的特异性。PCR仪也叫基因扩增仪,它是利用PCR技术对特定基因做体外的大量合成,用于以检测DNA/RNA为目的的各种基因分析。

③DNA 聚合酶:是 DNA 复制的动力,在 dNTP
等底物存在时在引物的引导下沿着模板 DNA 合成互补的 DNA 链。

北京莱普特PCR扩增仪操作步骤

文章来源,仪器仪表世界网

④缓冲液:提供DNA合成反应所需的PH,离子强度等环境。

  1. 在0.2mlEppendorf管内配制反应体系:

  2. 选择new进入编程操作

  3. 按下列程序进行编程: 94℃变性50sec; 72℃延伸10 sec;

  4. 72℃彻底延伸10min

  5. 从file菜单中,调取程序;

  6. 按回车键确认后,按照提示输入相应的配制反应体系体系;

  7. 程序结束后,取出Eppendorf管。

  8. 电泳检测PCR结果。

⑤4种单核苷酸:dNTP,提供DNA合成原料。2、PCR原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性–退火–延伸三个基本反应步骤构成。①
模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②
模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:DNA模板–引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性–退火–延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍(Plateau)。
到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。在此同时认识到蛋白质是接受RNA的遗传信息而合成的。

北京莱普特PCR扩增仪保养

这三个热反应过程的重复称为一个循环,经过 20-40
个循环可扩增得到大量位于两条引物之间序列的 DNA 片段。

1.样品池的清洗先打开盖子,然后用95%乙醇或10%清洗液浸泡样品池5min,然后清洗被污染的孔;用微量移液器吸取液体,用棉签吸干剩余液体;打开PCR仪,设定保持温度为50℃的PCR程序并使之运行,让残余液体挥发去除。一般5——10min即可。

PCR 原理示意图

2.热盖的清洗对于荧光定量PCR仪,当有荧光污染出现,而且这一污染并非来自样品池时,或当有污染或残迹物影响到热盖的松紧时,需要用压缩空气或纯水清洗垫盖底面,确保样品池的孔干净,无污物阻挡光路。

3.仪器外表面的清洗清洗仪器的外表面可以除去灰尘和油脂,但达不到消毒的效果。选择没有腐蚀性的清洗剂对PCR仪的外表面进行清洗。

4.更换保险丝先将PCR仪关机,拔去插头,打开电源插口旁边的保险盒,换上备用的保险丝,观察是否恢复正常。

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