沉睡的微生物菌种,常用的微生物菌种保藏方法

by admin on 2019年12月19日

粘质沙雷伯氏菌注意事项如下:

定期移植法▼

图片 1图为微生物菌种库。目前,我国普通微生物菌种保藏中心保藏的专利菌株为11977个,位列全球第2。

1、菌种操作应在无菌条件下进行,防止杂菌污染。

亦称传代培养保藏法,包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种接种于适宜的培养基中,最适条件下培养,待生长充分后,于4~6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。

一株在中国普通微生物菌种保藏管理中心沉睡了20年之久的古老菌种,最近因为韩春雨事件火了起来。这个叫做格氏嗜盐碱杆菌的菌种,在河北科技大学副教授韩春雨的利用下,实现了基因组编辑技术NgAgo-gDNA而出名。

2、取细胞的过程中注意带好防冻手套,护目镜。此项尤为重要,细胞冻存管可能漏入液氮,解冻时冻存管中的气温急剧上升,可导致爆炸。

操作步骤如下:

日前发布的《中国微生物资源发展报告2016》显示,世界各保藏中心共保有96907个用于专利程序的生物材料,其中中国普通微生物菌种保藏中心保藏的专利菌株为11977个,位列全球第2。

3、微生物菌种应保藏于低温、清洁和干燥的地方,室温放置时间过长会导致菌种衰退。

1.培养基制备

9月14日,记者走进中国普通微生物菌种保藏管理中心,探寻微生物菌种的日常生活。

4、离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高,注意加入少量培养液可稀释其浓度,以减少对细胞的损伤。

①器皿准备

支撑未来的“生命”银行

5、斜面菌种保藏时间通常为3-6个月,应根据菌种状况及时转接;冻干菌种保藏时间通常为2-15年;菌种保存使优良菌种的性状保持稳定,人为地创造条件,使菌种的新陈代谢活动处于不活泼状态,即选取优良菌种的休眠体或富有生命力的悬浮液在低温或脱水状态下保存。

培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿,如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等,经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。

中国普通微生物菌种保藏管理中心高级工程师辛玉华说,格氏嗜盐碱杆菌是20年前由中科院微生物所老所长周培瑾研究员从苏格兰交换来到中国,其最先分离于肯尼亚马加迪湖。作为保藏中心五千多种微生物中的一员,格氏嗜盐碱杆菌或通过真空冷冻干燥法,或借助-190℃左右的液氮超低温冻结法处于休眠状态。

①石蜡油封存法,在斜面菌种培养物上,倒上灭菌后的石蜡油,高出斜面1cm,于4℃冰箱或低温干燥处保存,粘质沙雷伯氏菌保存中这种方法不适用于能利用石蜡油作碳源的微生物,保存期为一年以上。

②溶解培养基配料

一些菌种甚至在冷藏室中沉睡了半个多世纪,“一旦有需求,它们就会被唤醒并投入应用。”辛玉华说。但如今,地球上99%的微生物人类还是不知道如何培养。只有经过培养,才知道它们未来能够做什么,并最终实现利用。

②冷冻干燥法,将孢子悬浮液与保护剂相混合,放在安瓿管内于-20——-30℃的乙醇浴中速冻。然后,在低温下用真空泵抽干,并用五氧化二磷或干冰使水汽结冻,熔封安瓿管,于低温下保存。保存期可达5——10年之久。

先在烧杯中放适量水,按培养基配方称取各项材料,依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解,最后加足水量,搅拌均匀。

“我们选择的菌种,一般要有潜在应用价值和丰富的生物多样性。现在,越来越多的微生物被‘唤醒’,并在各个领域一显身手。”辛玉华说。菌保中心保藏的微生物是经过几代人长期且持续累积来的,只有时间才能体现微生物资源保藏的价值。另外,微生物资源事关生物技术创新的未来。

③沙土保存法,能产孢子的细菌、放线菌及霉菌可采用此法保存,即将沙和土以3:2比例混合,经稀酸处理洗净过筛,装入小试管内,装置高度为1cm;灭菌2——3次,烘干后即可将在斜面培养基上生长良好的孢子,用无菌蒸馏水2——2.5ml制成孢子悬液,吸取少许加入沙土管中,经真空抽干,外观呈松散状态,于4℃冰箱保存,保存期可达5——7年。

③调pH值

值得注意的是,今年5月,美国宣布启动“国家微生物组计划”,美国政府将在未来两年投入1.21亿美元作为启动资金,数十所大学和研究机构未来几年将投入4亿美元。

①液氮超低温保存法,将生长稳定期的粘质沙雷伯氏菌细胞悬浮在10%甘油或其他低冰点液体中,密封于安瓿管内,然后控制冷却速度,使安瓿管温度逐步下降至
-35℃时,即可置于-150——-196℃的液氮罐中保存。大多数微生物如病毒、噬菌体、多种细菌、放线菌、酵母和原虫、特别是一些用冷冻干燥法有困难的微生物,都可用此法长期保存。

配料溶解后将培养基冷却至室温,根据要求加稀酸(0.1mol/L盐酸)或稀碱调pH值。加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌,防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。

菌种保藏有双重“保险”

②简单保存法,将琼脂斜面孢子培养物、菌丝悬浮液以及由麸皮、大米、小米等谷物原料制成的孢子培养物置于4℃冰箱保存,保存时间不超过1——2个月,若将谷物原料制备的孢子瓶抽真空并在棉塞上浸蜡,以隔绝外界空气和水汽,保持时间可达3——4个月。

④加凝固剂

作为我国可同时提供一般菌种资源服务和专利生物材料保存的国家级保藏中心,保藏中心于1995年被列入“布达佩斯条约国际保藏单位”,成为一个持有国际牌照的微生物“银行”。

6、冻存液的问题:冻存液的配置已是常识,在这里不作详述,但二甲基亚砜对细胞不是完全无毒副作用,在常温下,二甲基亚砜对细胞的毒副作
较大,因此,必须在1-2min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢,会造成细胞的损伤,二甲基亚砜最好选择进口产品。

配制固体培养基时需加凝固剂,如琼脂、明胶等。将凝固剂加入液体培养基中,加热并不断搅拌至融解,再补足所蒸发水分。

“这里主要是收集、保藏、鉴定、交换和供应各类生物材料。”辛玉华告诉科技日报记者,一些研发中分离出的菌种,暂时不知道有什么功能,就作为资源储备储存;而研究课题需要收集、筛选的菌类,结题后也可存放备份。几十年来,保藏中心共提供了几十万株各类微生物菌种,在我国生命科学和生物技术研发中贡献卓著。

⑤过滤分装

走进位于地下的保藏中心,空气中弥漫着丝丝凉气,和室外的闷热对比鲜明。在这间百十来平米的液氮生物储罐室中,放满了30来个容量为750升的“大罐子”,5.3万个如细菌、真菌、酵母等的微生物菌种暗藏其中。

在二层纱布中间夹入脱脂棉,将配好的培养基趁热过滤并分装。斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一,穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。分装过程中勿使培养基沾污管口,以免弄湿棉塞造成污染。

“几乎所有的菌种都贮存于液氮中,生物材料都先在这里保藏并‘备份’。”辛玉华提起一个液氮罐盖子,蒸腾着的氮气扑面而来,记者下意识的往后退了下。透过缭绕的雾气,各式各样的微生物菌种在小铁盒子里“睡大觉”。

⑥包扎标记

“液氮罐里的温度维持在-190℃左右,菌种在这里可以保存几十年。”辛玉华指着天花板说,当液氮变少时,楼上的“巨无霸”液氮罐会自动感应并及时添加,这些造价昂贵的“制冷剂”从天津直运而来。

将试管加棉塞,外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。

来到低温冷藏室,好像进了银行的保险库。一排排直抵天花板的不锈钢铁柜,每个柜子整齐排列着很多像“抽屉”般的隔间。拉出一个“抽屉”,就能看到很多支真空小玻璃管里存放着不同编号的菌种。试管中装有淡黄色、已经干燥处理的保护剂,藏在其中的是“休眠”中的微生物,这种保藏方法就被称为真空冷冻干燥法。

⑦灭菌

经过双重“保险”保藏的菌种,一株菌售价只有500—1000元。作为公益性机构,保藏中心的价格不贵且质量有保证。值得注意的是,新的微生物物种需要经过保藏中心核实、保藏后才能在国际期刊生效发表,而这正是中国普通微生物菌种保藏中心具有的权威性。

根据要求将培养基灭菌,通常蒸汽灭菌为121℃,15~20min。

一个菌种的“生死”循环

⑧斜面摆放

目前,保藏中心保存有各类微生物资源5700种、50000余株,用于专利程序的生物材料有1万余株。那么,数目庞大的微生物资源,从“清醒”到被“沉睡”经历了什么?

灭菌后及时摆放斜面,斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。

“菌种被送来后,首先进行存活度和纯度检测,然后用基因测定来核实菌种的正确性,继而用真空冷冻干燥法或液氮超低温冻结法保存菌种。”辛玉华说,保藏菌种时一般两种方法会互为备份,使用液氮法保存6份,真空法则要备份12个。

⑨无菌检查

“通过冷冻技术处理后,细菌就会处于休眠状态。如果要活化使用,则需通过相应的培养液进行活化,才能恢复活性。”辛玉华以格氏嗜盐碱杆菌为例说,复活菌种所需的营养为:20%的氯化钠,酪蛋白、氨基酸、pH值为9等,在适宜的温度和培养基中,这些沉睡的细菌便会被重新唤醒。

将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验,通常30℃培养1~3天。无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。

专利靠前但“短板”尚存

2.接种

如今,这里还保存着中科院微生物所送给毛主席的第一支灵芝菌种,有利于女性减肥的鼠李糖乳杆菌,还有可以减少田间施肥的同氮菌……

①斜面接种

科学家相信,当今时代人类面临的挑战,包括养活众多的人口、生产可持续的能源、保护环境或减缓对环境的破坏,以及人类健康等等,都与生物学相关,可以从微生物世界中找到解决方案。

a.点接

于是,越来越多的菌种被发现并唤醒后应用于人们生活。和其他知识产权专利不同,微生物是唯一一种可通过专利保护的生命形式,过去几年间,我国专利微生物年保藏量增长速度一直位居世界第一。

把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌。

在保藏中心工作了20年的辛玉华坦言,自2000年以来硬件设施得到极大改善,如今这里拥有了全世界一流的实验设备。但记者在实验室看到,像氨基酸分析仪、λ35紫外可见分光光度计及PTP1温控系统、Qpix2全自动菌落挑取系统、变性高效液相色谱仪等必备高端设备,均产自德国、美国、日本;而国产的仅有普通冰箱、电磁炉、色谱仪等低端设备。

b.中央划线

“硬件设施和保藏技术都是国际先进,和国外的差距是菌种种类的多样性还不够丰富。”辛玉华介绍,美国典型菌种保藏中心为纯商业机构,菌种保藏的较全面、应用型也更强;德国微生物菌种保藏中心是欧洲规模最大的生物资源中心,细菌菌种保存见长;而半政府性质的荷兰微生物菌种保藏中心,真菌菌种最为齐全。

从斜面中央自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌等。

“保藏中心一方面通过各种途径广泛收集新物种及新用途菌株,另一方面也与国外一流的菌保中心互相交换菌种,进而补充丰富菌种种类。”辛玉华说,此前世界微生物数据中心发表了全球微生物资源数据共享北京宣言,倡导重大微生物信息化国际合作计划,推动全球微生物资源信息化建设迈向新高度。

c.稀波状蜿蜒划线法

(原载于《科技日报》2016-09-22 05版)

从斜面底部自下而上划“之”字形线。适用于易扩散的细菌,也适用于部分真菌。

d.密波状蜿蜒划线法

从斜面底部自下而上划密“之”字形线。能充分利用斜面获得大量菌体细胞,适用于细菌和酵母菌等。

e.挖块接种法

挖取菌丝体连同少量培养基,转接到新鲜斜面上。适用灵芝等担子菌类真菌。

②穿刺接种

用接种针从原菌种斜面上挑取少量菌体,从柱状培养基中心自上而下刺入,直到接近管底,然后沿原穿刺途径慢慢抽出接种针。适用于细菌和酵母菌等。

③液体接种

挑取少量固体斜面菌种或用无菌滴管等吸取原菌液接种于新鲜液体培养基中。

3.培养

将接种后的培养基放入培养箱中,在适宜的条件下培养至细胞稳定期或得到成熟孢子。细菌培养温度一般为30~37℃,真菌培养温度一般为25~28℃。

4.保藏

培养好的菌种于4~6℃保存,根据要求每3~6个月移植一次。某些菌种,如芽裂酵母,阿舒假囊酵母,棉病囊霉等,须1~3个月移植一次。

保藏湿度用相对湿度表示,通常为50%~70%。

斜面菌种应保藏相继三代培养物以便对照,防止因意外和污染造成损失。

液体石蜡法▼

亦称矿物油保藏法,定期移植保藏法的辅助方法。是指将菌种接种在适宜的斜面培养基上,最适条件下培养至菌种长出健壮菌落后注入灭菌的液体石蜡,使其覆盖整个斜面,再直立放置于低温干燥处进行保存的一种菌种保藏方法。

操作步骤如下:

1.液体石蜡的准备

选用优质化学纯液体石蜡,将液体石蜡分装加塞,用牛皮纸包好,采用以下两种方式进行灭菌:

121℃湿热灭菌30min,置40℃恒温箱中蒸发水分,经无菌检查后备用。

160℃干热灭菌2个小时,冷却后,经无菌检查后备用。

2.斜面培养物的制备

参照定期移植法。

3.灌注石蜡

将无菌的液体石蜡在无菌条件下注入培养好的新鲜斜面培养物上,液面高出斜面顶部1cm左右,使菌体与空气隔绝。

4.保藏

沉睡的微生物菌种,常用的微生物菌种保藏方法。①注入液体石蜡的菌种斜面以直立状态置低温干燥处保藏,保藏时间2~10年。

②保藏期间应定期检查,如培养基露出液面,应及时补充无菌的液体石蜡。

5.恢复培养

恢复培养时,挑取少量菌体转接在适宜的新鲜培养基上,生长繁殖后,再重新转接一次。

沙土管法▼

是载体保藏法的一种。将培养好的微生物细胞或孢子用无菌水制成悬浮液,注入灭菌的沙土管中混合均匀,或直接将成熟孢子刮下接种于灭菌的沙土管中,使微生物细胞或孢子吸附在沙土载体上,将管中水分抽干后熔封管口或置干燥器中于4~6℃或室温进行保存的一种菌种保藏方法。

操作步骤如下:

1.沙土管制备

将河沙用60目过筛,弃去大颗粒及杂质,再用80目过筛,去掉细沙。用吸铁石吸去铁质,放入容器中用10%盐酸浸泡,如河沙中有机物较多可用20%盐酸浸泡。24小时后倒去盐酸,用水洗泡数次至中性,将沙子烘干或晒干。

另取地面下40~60cm非耕作层贫瘠且粘性较小的土,研碎,100目过筛,水洗至中性,烘干。

将处理后的沙、土按质量比2∶1混合。混匀的沙土分装入安瓿管或小试管中,高度为1cm左右,塞好棉塞,121℃湿热灭菌30min。

随机抽取灭菌后的砂土管若干支,无菌条件下取少许砂土至营养肉汁培养基中,30℃培养24小时,检查无微生物生长后方可使用。

2.斜面培养物的制备

参照定期移植法。

3.制备菌悬液

向培养好的斜面培养物中注入3~5mL无菌水,洗下细胞或孢子制成菌悬液。用无菌吸管吸取菌悬液,均匀滴入沙土管中,每管0.2~0.5mL。放线菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。

4.干燥

真空抽去沙土管中水分。

5.保藏

将沙土管用火焰熔封后存放于低温干燥处保藏,每隔半年检查一次菌种存活性及纯度。或将沙土管直接用牛皮纸或塑料纸包好,置干燥器内保存。

保藏时间2~10年。

6.恢复培养

无菌条件下打开沙土管,取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上,长出菌落后再转接一次。或取沙土粒于适宜的液体培养基中,增殖培养后再转接斜面。

真空冷冻干燥法▼

将微生物冷冻,在减压下利用升华作用除去水分,使细胞的生理活动趋于停止,从而长期维持存活状态。

操作步骤如下:

好氧菌冷冻干燥管的制备

1.安瓿管准备

安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时,先用2%盐酸浸泡过夜,自来水冲洗干净后,用蒸馏水浸泡至pH中性,干燥后、贴上标签,标上菌号及时间,加入脱脂棉塞后,121℃下高压灭菌15-20分钟,备用。

2.保护剂的选择和准备

保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时,应注意其浓度及pH值,以及灭菌方法。如血清,可用过滤灭菌;牛奶要先脱脂,用离心方法去除上层油脂,一般在100℃间歇煮沸2-3次,每次10-30分钟,备用。

3.冻干样品的准备

在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期,进行纯度检查后(参见科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件《微生物菌种纯度检测技术规程》,与保护剂混合均匀,分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010个/ml为宜(以大肠杆菌为例,为了取得每毫升1010个活细胞菌液2毫升-2.5毫升,只需10毫升琼脂斜面两支)。采用较长的毛细滴管,直接滴入安瓿管底部,注意不要溅污上部管壁,每管分装量约0.1~0.2毫升,若是球形安瓿管,装量为半个球部。若是液体培养的微生物,应离心去除培养基,然后将培养物与保护剂混匀,再分装于安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短,最好在1~2小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。

4.预冻

一般预冻2小时以上,温度达到-20℃到-35℃左右。

5.冷冻干燥

采用冷冻干燥机进行冷冻干燥。

将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内,开始冷冻干燥,时间一般为8-20小时。

6.真空封口及真空检验

将安瓿管颈部用强火焰拉细,然后采用真空泵抽真空,在真空条件下将安瓿管颈部加热熔封。

熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪测定真空度。

7.保藏

安瓿管应低温避光保藏。

8.质量检查

冷冻干燥后抽取若干支安瓿管进行各项指标检查,如存活率、生产能力、形态变异、杂菌污染等。

①厌氧菌冷冻干燥管的制备

主要程序与需氧菌操作相同,注意保护剂的选择和准备,保护剂使用前应在100℃的沸水中煮沸15分钟左右,脱气后放入冷水中急冷,除掉保护剂中的溶解氧。

②复苏方法

先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部,将安瓿管顶部烧热,用无菌棉签沾冷水,在顶部擦一圈,顶部出现裂纹,用挫刀或镊子颈部轻叩一下,敲下已开裂的安瓿管的顶端,用无菌水或培养液溶解菌块,使用无菌吸管移入新鲜培养基上,进行适温培养。

-80℃冰箱冻结法▼

将菌种保藏在-80℃冰箱中以减缓细胞的生理活动进行冷冻的一种保藏方法。

操作步骤如下:

1.安瓿管的准备

安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时,先用2%盐酸浸泡过夜,自来水冲洗干净后,用蒸馏水浸泡至pH中性,干燥后、贴上标签,标上菌号及时间,加入脱脂棉塞后,121℃下高压灭菌15-20分钟,备用。

2.保护剂的选择和准备

保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时,应注意其浓度及pH值,以及灭菌方法。如血清,可用过滤灭菌;牛奶要先脱脂,用离心方法去除上层油脂,一般在100℃间歇煮沸2-3次,每次10-30分钟,备用。

3.微生物保藏物的准备

在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期,进行纯度检查后(参见科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件《微生物菌种纯度检测技术规程》,与保护剂混合均匀,分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010个/ml为宜(以大肠杆菌为例,为了取得每毫升1010个活细胞菌液2毫升-2.5毫升,只需10毫升琼脂斜面两支)。采用较长的毛细滴管,直接滴入安瓿管底部,注意不要溅污上部管壁,每管分装量约0.1-0.2毫升,若是球形安瓿管,装量为半个球部。若是液体培养的微生物,应离心去除培养基,然后将培养物与保护剂混匀,再分装于安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短,最好在1-2小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。

4.冻结保藏

将安瓿管或塑料冻存管置于-80℃冰箱中保藏。

5.复苏方法

从冰箱中取出安瓿管或塑料冻存管,应立即放置38℃-40℃水浴中快速复苏并适当快速摇动。直到内部结冰全部溶解为止,约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管,将内容物移至适宜的培养基上进行培养。

液氮超低温冻结法▼

液氮超低温保藏技术是将菌种保藏在-196℃的液态氮,或在-150℃的氮气中的长期保藏方法,它的原理是利用微生物在-130℃以下新陈代谢趋于停止而有效地保藏微生物。

操作步骤如下:

1.安瓿管或冻存管的准备

用圆底硼硅玻璃制品的安瓿管,或螺旋口的塑料冻存管。注意玻璃管不能有裂纹。将冻存管或安瓿管清洗干净,
121℃下高压灭菌15-20分钟,备用。

2.保护剂的准备

保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时,应注意其浓度,一般采用10-20%甘油。

3.微生物保藏物的准备

微生物不同的生理状态对存活率有影响,一般使用静止期或成熟期培养物。

分装时注意应在无菌条件下操作。

菌种的准备可采用下列几种方法:

①刮取培养物斜面上的孢子或菌体,与保护剂混匀后加入冻存管内;

②接种液体培养基,振荡培养后取菌悬液与保护剂混合分装于冻存管内;

③将培养物在平皿培养,形成菌落后,用无菌打孔器从平板上切取一些大小均匀的小块(直径约5-10毫米),真菌最好取菌落边缘的菌块,与保护剂混匀后加入冻存管内;

④在小安瓿管中装1.2-2毫升的琼脂培养基,接种菌种,培养2-10天后,加入保护剂,待保藏。

4.预冻

预冻时一般冷冻速度控制在以每分钟下降1℃为好、使样品冻结到-35℃。

目前常用的有三种控温方法:

①程序控温降温法,应用电子计算机程序控制降温装置,可以稳定连续降温,能很好地控制降温速率。

②分段降温法:将菌体在不同温级的冰箱或液氮罐口分段降温冷却,或悬挂于冰的气雾中逐渐降温。一般采用二步控温,将安瓿管或塑料小管,先放-20℃至-40℃冰箱中1-2小时,然后取出放入液氮罐中快速冷冻。这样冷冻速率大约每分钟下降1-1.5℃。

③对耐低温的微生物、可以直接放入气相或液相氮中。

5.保藏

将安瓿管或塑料冻存管置于液氮罐中保藏。一般气相中温度为-150℃,液相中温度为-196℃。

6.复苏方法

从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管,应立即放置在38℃-40℃水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止,一般约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管,将内容物移至适宜的培养基上进行培养。

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